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博格隆纯化解析丨RSV疫苗纯化方案分享

博格隆纯化解析丨RSV疫苗纯化方案分享
2024-11-26

人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是一种非节段性单股复链RNA病毒,属于副黏病毒科,肺病毒属,肺病毒亚科,分A、B两个亚型,呈季节性流行:A、B亚型交替或共循环。

RSV的基因组全长为15.2Kb,编码11个病毒蛋白,其中病毒包膜上有三种蛋白:粘附蛋白G,融合蛋白F和小疏水蛋白SH。G和F蛋白在病毒感染过程中起核心作用,因此在RSV疫苗开发中,主要针对G蛋白和F蛋白开展抗原设计。

目前国内外RSV疫苗按照研发技术路线可分为:重组减毒活病毒(LAVs)疫苗、重组亚单位疫苗、mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗。

RSV重组减毒活病毒(LAVs)疫苗

与其他类型的疫苗相比,在不强制添加佐剂的情况下,重组减毒活疫苗(LAVs)诱导的免疫应答与病原体自然感染时的应答相似,从而诱导更高的免疫应答。代表性的产品有Blue Lake Biotechnology的BLB-201,Codagenix公司的CodaVax-RSV,Sanofi Pasteur的VAD00001等。

此类疫苗生产需要获得减毒活病毒,可采用的工艺如下:

将收获的病毒液经过核酸酶处理和过滤澄清后,利用博格隆复合模式层析填料Diamond Layer 700填料进行纯化,以高效去除宿主蛋白和核酸。此工艺具有高上样量(可达10 CV)和高回收率(50%~60%)的优点,确保病毒的纯度和活性。

Fig. 1 RSV重组减毒活病毒获取工艺流程

RSV重组亚单位疫苗

研发机构通常选择RSV的G或F表面蛋白进行抗原分子设计,此类疫苗由于缺乏整个病原体的基因组,具有更高的疫苗安全性水平,适用于免疫功能低下的人群或老年人。采用G蛋白的代表如艾棣维欣,采用F蛋白的代表为GSK的Arexvy和辉瑞的双价RSV疫苗Abrysvo。

以制备F蛋白为例,可采用以下工艺过程:经CHO细胞培养,收获上清并澄清,第一步层析为博格隆亲和填料Diamond Viru-S对RSV Pre F蛋白捕获和提纯,宿主蛋白流穿。第二步使用博格隆高分辨阴离子交换填料Diamond Q Mustang层析,采用结合洗脱模式进一步去HCP和HCD等杂质。第三步层析可使用博格隆复合模式填料Diamond MIX-A结合模式,实现产品相关杂质和痕量宿主蛋白的去除。随后进行纳滤、超滤和除菌过滤获得抗原原液。

Fig. 2 抗原原液获取工艺流程

RSV mRNA疫苗

mRNA作为疫苗平台只携带特定蛋白的遗传信息,由于宿主遗传物质受到干扰和修饰的可能性较低,因此具有较高的安全性。代表性产品如Moderna的mRNA-1325。mRNA类疫苗工艺包括了质粒模板的制备、mRNA的合成与纯化、LNP的制备及无菌灌装等步骤。

质粒的制备工艺可以选择经典的三步法工艺:

Fig. 3 质粒纯化三步法工艺流程


使用限制性内切酶获得的线性化质粒DNA,可使用博格隆强阴离子交换层析介质Q Bestarose HP去除较大的宿主基因组DNA、质粒DNA及部分酶。

体外转录后的mRNA形式RSV疫苗纯化,捕获层析可选用博格隆复合模式填料Diamond Layer 700,流穿模式有效去除消化后的pDNA、酶及NTP等工艺相关杂质。

精细纯化可以选择博格隆高分辨率强阴离子交换填料如Diamond Q Mustang或BestPoly 30Q,也可以选择博格隆高分辨率疏水填料Diamond Phenyl Mustang或Diamond Butyl Mustang,去除片段或dsRNA等产品相关杂质。

Fig. 4 mRNA形式RSV疫苗纯化工艺流程

RSV病毒载体疫苗

用于RSV疫苗的病毒载体类型主要有腺病毒载体和痘病毒载体。已批准上市的腺病毒载体新冠疫苗具有较为成熟的生产工艺。RSV病毒载体疫苗代表性研发厂家为Janssen和Bavarian Nordic。

以腺病毒载体为例,可采用以下工艺:

HEK293细胞培养和病毒感染,感染结束后可以用表面活性剂对细胞进行裂解,核酸酶进行宿主核酸的降解,裂解液经深层滤器进行澄清,再经300 kDa的中空纤维进行浓缩及换液,而后经过Diamond Q Mustang初步纯化及Diamond Layer 700精细纯化,层析后料液通过300 kDa超滤浓缩换液得到最终的疫苗原液。

Fig. 5 疫苗原液获取工艺流程

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关于博格隆

博格隆成立于2008年,是一家专注于为分离纯化提供高质量层析介质的高新技术企业,是中国较早具备大规模生产分离纯化介质能力的企业之一。博格隆所提供的产品涵盖各类分离纯化介质、预装柱、实验室及工业生产级空柱、微载体,同时提供分离纯化工艺开发服务及填料定制。


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